Doctorado en Ciencias de la Salud

Los modelos in vitro intestinales convencionales (ej.: líneas celulares) replican pobremente las características morfológicas y funcionales del intestino. Los organoides intestinales son un modelo in vitro que ha revolucionado el campo de fisiología intestinal y del modelamiento de enfermedades. Los organoides son estructuras tridimensionales (3D) que se derivan de células madre adultas que bajo condiciones óptimas de cultivo pueden dar lugar a sistemas con características morfológicas y funcionales muy similares a las del tejido in vivo que representan. Particularmente, los organoides intestinales están compuestos por un epitelio dispuesto en estructuras similares a las criptas y vellosidades intestinales, y que contiene los diversos tipos celulares del intestino. Este epitelio tiene las membranas apical y basal dispuestas hacia el lumen y superficie externa del organoide, respectivamente. Al transformar la estructura 3D del organoide a una 2D (monocapa), el lado apical del epitelio queda accesible para estudios que requieran un contacto directo a esta membrana, como son: interacción hospedero-patógeno, testeo de drogas, estudio de mucinas intestinales, estudio de receptores de la membrana apical, etc. Las alpacas son una especie con gran relevancia social y económica para el Perú. Lamentablemente, su producción se ve altamente afectada por enfermedades infecciosas, en especial las infecciones entéricas que suelen presentarse con altas tasas de mortalidad y morbilidad. Aún existen vacíos en el conocimiento de la función intestinal de las alpacas, limitando los estudios de la patogenia de microorganismos infecciosos intestinales, y por tanto, dificultando la formulación de tratamientos y vacunas efectivos. En este sentido, los organoides intestinales de alpaca representarían una valiosa herramienta para estudiar primero la función intestinal, específicamente la barrera intestinal y luego la patogenia de agentes infecciosos intestinales in vitro. Proveyendo de conocimiento significativo y necesario para avanzar hacia la investigación de potenciales tratamientos y vacunas. Este estudio tiene como objetivo generar organoides intestinales en sus formas 3D y 2D de alpaca y su validación como modelo in vitro. Para lo cual, segmentos intestinales de alpacas, sacrificadas por fines distintos a la investigación (por ej. faenamiento), serán utilizadas para aislar criptas intestinales mediante su disociación enzimática con EDTA. Las criptas se resuspenderán en Matrigel y se suplementarán con medio de cultivo comercial para organoides intestinales. La generación de monocapas intestinales será a través de la disociación mecánica y enzimática de organoides, hasta la obtención de una solución de células individuales que serán sembradas en insertos de sistemas Transwell cuyas membranas serán cubiertas con Matrigel. Con el fin de caracterizar los organoides y monocapas intestinales, la morfología será descrita a nivel microscópico y ultraestructural (microscopia electrónica de barrido y de transmisión). Asimismo, serán procesadas para histoquímica (hematoxilina y PAS) e inmunofluorescencia (Ki-67, lisozima, caspase-3, GLP-1, glucose transporter 2 [GLUT-2], y sodium-glucose cotransport 1 [SGLT-1]). .Se estudiará la integridad de ZO-1, mediante el análisis de tortuosidad de proteínas ZO-1 en monocapas intestinales. También se realizarán los tests FITC-Dextrano 4 y de Resistencia eléctrica transepitelial para analizar la integridad de la barrera intestinal en organoides y monocapas intestinales respectivamente. Los resultados de este estudio sentarán las bases para la adecuada caracterización del primer modelo in vitro en alpacas y garantizará su uso futuro para estudios de interacción hospedero-patógeno y ensayos de tratamientos o vacunas.

LOPEZ CERVANTES ,VERONICA MARTINA