Implementación y optimización de las tecnologías de criopreservación y transfección de gametos masculino del langostinoLitopenaeus vannamei

El langostino blanco “Litopenaeus vannamei” es uno de los productos de exportación de mayor interés en la región norte del Perú así como en otros países. Sin embargo su cultivo es amenazado y a menudo afectado por la aparición de infecciones virales y bacterianas. El equipo científico de Incabiotec ha realizado muchos estudios en patología, inmunología y genética del langostino, desarrollando programas de mejoramiento genético, iniciados en el 2001 con el grupo Camaco en Panamá y a partir del 2004 con el grupo Queiroz en Brasil, lo que condujo a la selección de líneas de langostinos altamente resistentes a los virus WSSV e IMNV respectivamente. En Perú, Incabiotec asesoró al grupo Marinazul, para implementar un programa similar basado en infecciones experimentales por WSSV y selección de animales sobrevivientes durante varias generaciones. El equipo científico ha mostrado que la inseminación artificial de los langostinos hembras susceptibles con esperma proveniente de machos resistentes a infecciones virales conduce a un incremento significativo de la resistencia en la progenie. Por otro lado, el equipo dispone de un protocolo de nested-PCR para certificar la ausencia de virus en los reproductores y en el esperma. La necesidad urgente de disponer de líneas de langostinos multi-resistentes a virus conduce a considerar la implementación y optimización de tecnologías, por una parte de crio-preservación de esperma para realizar cruces entre líneas mono-resistentes ubicadas en varias regiones del mundo, y por otra parte de transfección de esperma con ADN para poder generar mutaciones dirigidas en genes que permitan la obtención de líneas resistentes. La crio-preservación de gametos, y en particular de esperma, tiene como fin la conservación a temperaturas muy bajas (de – 80°C a -196°C) por largos períodos, disminuyendo así las funciones vitales de las células y manteniéndolas en un estado de “vida suspendida”. Así, mediante el control de parámetros de congelación y descongelación, en medios especiales, las células espermáticas provenientes de organismos resistentes, pueden ser almacenadas y utilizadas posteriormente para la inseminación artificial de hembras, y la obtención de una progenie resistente. En el campo de la ingeniería genética y en particular en las técnicas de transfección de ácidos nucleicos en células, nuevos reactivos son actualmente disponibles, los cuales hacen posible la transferencia de construcciones genéticas funcionales dentro de las células, y la obtención de células genéticamente modificadas con nuevas características fenotípicas (ej. la resistencia a virus). Las metodologías de transfección combinadas con las nuevas tecnologías de edición de genomas (TALEN, CRISPR), abren la posibilidad de mutar genes propios del organismo logrando su mejoramiento genético de importancia tanto científica como comercial. Este proyecto de investigación aplicada apunta a implementar y optimizar protocolos de criopreservación de esperma/espermatóforos del langostino blanco “Litopenaeus vannamei” considerando diferentes soluciones de crioprotección, las cuales serán probadas a distintas concentraciones y tiempos de exposición; se evaluarán varias tasas de enfriamiento y congelación para seleccionar la de mejor eficiencia, además se determinará la viabilidad espermática en diferentes períodos de crioconservación, finalmente se estudiará el efecto del congelamiento sobre las tasas de fertilización post inseminación. En cuanto a la transfección, se optimizarán protocolos de transfección del esperma con los nuevos reactivos disponibles en el mercado, por lo cual se evaluarán diferentes combinaciones de concentración de soluciones transfectantes y vectores plasmídicos, en relación con la eficiencia de la transfección y las tasas de fertilización.