Análisis mediante citometría de flujo y casa de la respuesta de los esperamtozoides de alpaca a diferentes protocolos de crioconservación

Para el análisis mediante citómetria de flujo y CASA de la respuesta de los espermatozoides de alpaca a diferentes protocolos de crioconservación, se estudiara la sustitución de varios de los componentes clásicos utilizados en la congelación espermática: primero, se determinara el diluyente control de congelación. Segundo, se determinara el crioprotector y temperatura de equilibrio en la crioconservación. Tercero, se evaluara la curva de enfriamiento en la congelabilidad. Cuarto, se estudiara la substitución del crioprotector de origen animal. Quinto, se evaluara la optimización del protocolo de crioconservación. La colecta de semen será, por el método post-copula. Tras recolectar los eyaculados y valorar su motilidad y volumen, serán mezclados (pool) y se diluyeran con diluyente básico: Tris-Ac. Cítrico-Fructuosa y 20 % v/v de yema de huevo fresco de codorniz y dividido en las alícuotas requeridas en cada experimento. Las alícuotas de las distintas suspensiones serán refrigeradas a 5ºC durante 1.5 h. A esa temperatura se combinara con el dilutor básico más glicerol, obteniéndose una concentración final de 5% de glicerol y se dejara estabilizar por 20 min para envasar las muestras en pajuelas de 0.5 ml y congelar en vapores de nitrógeno y sumergidas en él hasta su descongelación (60'' a 37ºC). Los parámetros cinéticos en fresco, tras la descongelación serán analizados mediante el sistema CASA. Para evaluar la viabilidad, integridad de las membranas espermática y acrosomal, actividad mitocondrial y ADN en fresco y tras la descongelación, se utilizara el Citometro de Flujo. Con los mejores 2 tratamientos que se obtenga después de los análisis de los espermatozoides criopreservados, se inseminaran 120 alpacas hembras (60 alpacas/tratamiento) y se realizara el diagnostico de preñez con el objetivo de encontrar el mejor protocolo de crioconservación de los espermatozoides de alpaca.