INDICADORES DE FERTILIDAD EN ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE ALPACA: ESTUDIO DE LA APOPTOSIS ESPERMÁTICA, DESPOLARIZACIÓN DE MEMBRANA, INTEGRIDAD DE ADN Y ESTABILIDAD DE CROMATINA

La inseminación artificial en alpacas con semen congelado no es utilizada masivamente aun debido a las alternaciones que experimenta el espermatozoide durante el proceso de criopreservación. Es posible que existan determinados indicadores para predecir una potencial fertilidad en espermatozoides de alpaca. Por lo tanto, el objetivo de este proyecto es caracterizar mediante niveles de expresión génica y mediante citometría de flujo (1) niveles de apoptosis, (2) cambios en la polarización de la membrana plasmática y (3) la integridad y estabilidad del ADN/cromatina espermática, como potenciales indicadores de fertilidad. Se trabajarán con espermatozoides de alpaca, los cuales serán sometidos a un proceso de criopreservación convencional. Los parámetros moleculares y de función espermática serán evaluados antes y después del proceso de criopreservación. En el componente I se evaluarán niveles de Caspasa 3, Caspasa 7 (Cell Event Caspase 3-7®) y translocación de fosfatidil serina (Anexina V) como indicadores de apoptosis. En el componente II se evaluará la despolarización de membrana (DiSBAC2) y presencia de Sodio intracelular (Sodium Green cell indicator®). En el componente III se estudiará la integridad del ADN espermático (TUNEL), estabilidad de cromatina nuclear (naranja de acridina), deficiencia de protaminas (cromomicina A3) y presencia de tioles libres (monobromomimano). Todos los parámetros mencionados serán analizados mediante citometría de flujo. Adicionalmente, en el componente II, se evaluará mediante ELISA el funcionamiento de la bomba Sodio-Potasio ATPasa (Na+/K+ ATPasa Microplate assay kit®). Posteriormente, en el componente IV, se evaluarán mediante RT-PCR los niveles de expresión génica de los genes Protamina 2, Caspasa y VDAC3 durante el proceso de criopreservación. Finalmente, los resultados serán validados mediante pruebas de fecundación in vitro y mediante inseminación artificial en alpacas. Se espera identificar cual(es) de los parámetros mencionados tienen una relación más alta con la fertilidad in vitro e in vivo en alpacas. De esta manera, se podrán determinar que parámetros podrían ser empleados para predecir los congelabilidad de las muestras semen de alpaca y diseñar estrategias específicas para mejorar los protocolos de criopreservación y/o realizar una selección de machos o muestras más precisas antes de iniciar este proceso.