Implementación de la técnica de CRISPR-Cas12a combinada con LAMP para la detección molecular de Leishmania spp.

La Leishmaniasis es una enfermedad infecciosa endémica de zonas rurales presente en varias regiones del Perú. Es causada por parásitos del género Leishmania, cuya afectación se manifiesta en cuadros clínicos diversos, incidiendo sobre poblaciones de bajos recursos y con poco acceso a tratamiento médico oportuno. El presente proyecto de tesis tiene como objetivo la implementación y evaluación de un método de detección molecular de infecciones por Leishmania spp. en muestras clínicas basado en la técnica CRISPR-Cas12a en combinación con un paso de pre-amplificación de la secuencia de ADN diana por LAMP (técnica de amplificación isotérmica mediada en lazo), y su adaptación a un formato portátil accesible. Cabe resaltar que en las dos reacciones (LAMP y CRISPR) se emplearán enzimas recombinantes producidas in-house (Bst-LF ADN polimerasa y LbCas12a, respectivamente; la primera será producida como parte del presente trabajo). De esta manera, se busca encaminar el desarrollo de una prueba de diagnóstico molecular pan-Leishmania que pueda implementarse a futuro (luego de su validación clínica en campo) y así contribuir con el acceso a un diagnóstico temprano para los pacientes, particularmente en áreas endémicas de leishmaniasis en zonas rurales desatendidas. Para este fin se utilizarán dos dianas de detección multicopia: ADN del kinetoplasto (ADNk) y el gen ADNr 18S (que codifica el ARN ribosómico 18S). Se iniciará con la evaluación y optimización del rango de detección (sensibilidad analítica), seguido de pruebas de especificidad del sistema LAMP/CRISPR-Cas12a frente a cepas representativas de especies de Leishmania de los subgéneros Viannia y Leishmania, además de otras especies de microorganismos patógenos como Trypanosoma cruzi, Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium falciparum. Posteriormente se realizará la evaluación de la detección de Leishmania spp. en muestras clínicas, resultados que serán obtenidos a partir de lecturas de fluorescencia y del sistema portátil de tiras de flujo lateral. Se evaluarán los resultados estadísticamente, para lo cual se realizarán análisis de los datos de las lecturas de sensibilidad y especificidad analítica, además de pruebas de correlación entre los resultados que se obtendrán en muestras clínicas por la técnica LAMP/CRISPR y la prueba de referencia qPCR. Asimismo, se estimará la sensibilidad y especificidad diagnóstica de LAMP/CRISPR aplicada a muestras clínicas.

TIRADO JULCA ,INGRID AMANDA