Desarrollo y evaluación de un protocolo basado en la secuenciación MinION (Nanopore) para determinar la heterorresistencia en pacientes con tuberculosis directamente de muestras de esputo.

La resistencia a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis, dificulta la implementación de medidas de control de transmisión y el tratamiento de los pacientes. A pesar de ello, los mecanismos evolutivos de la resistencia a antibióticos durante el tratamiento no están descritos. La presencia de múltiples poblaciones de M. tuberculosis, especialmente cepas sensibles y resistentes a las principales drogas coexistiendo en un mismo paciente (heterorresistencia), puede tener un impacto sobre la respuesta a antibióticos y la diagnosis de resistencia. La heterorresistencia se define como la presencia de una cepa resistente en más de 1% de la población determinada en cultivos puros; sin embargo, poco se sabe de la concordancia de estos datos con respecto a los resultados obtenidos directamente de muestras de esputo. El análisis de las muestras de esputo es la base de las pruebas de diagnóstico rápidas y podrían ser usadas para la detección de la heterorresistencia. Actualmente, la susceptibilidad de M. tuberculosis a los diferentes fármacos se lleva a cabo con pruebas fenotípicas o con pruebas moleculares. Los métodos basados en el fenotipo detectan con mayor sensibilidad la heterorresistencia (hasta 1%); sin embargo, son laboriosos y toman varias semanas por lo que cada vez son menos usados. Los métodos moleculares son rápidos y sencillos de ejecutar, pero menos sensibles (5% en las pruebas con sondas en línea y 50% en los secuenciamientos). En los últimos años, el desarrollo de la tecnología del secuenciamiento de alto rendimiento de MinION (Nanopore) ha permitido mejorar su calidad e incrementar su accesibilidad a centros de bajos recursos debido a que son portables con insumos de bajo costo. Objetivos: En este estudio se busca el desarrollo de un protocolo basado en el secuenciamiento de alto rendimiento MinION (Nanopore) para la detección de la heterorresistencia en M. tuberculosis directamente en muestras de esputo. Asimismo, evaluar la sensibilidad de la detección de la heterorresistencia usando el MinION en pacientes con tuberculosis recientemente diagnosticados en Lima e Iquitos a partir de muestras de esputo y cepas puras. Estos objetivos serán cumplidos con apoyo de dos grupos de colaboradores, el University College London (UCL) y el Hospital Regional de Loreto. Los primeros nos darán apoyo en los procesos de secuenciamiento de MinION y en el análisis de datos obtenidos; mientras que los segundos nos permitirán contar con muestras de esputos de pacientes y finalmente probar in situ la factibilidad del protocolo desarrollado. Métodos: Estandarización. El método de extracción de ADN, la cantidad de ADN obtenido y las celdas de Nanopore serán evaluadas en el secuenciamiento de genes que determinan la resistencia a isoniacida, rifampicina y pirazinamida mediante el secuenciamiento de MinION (Oxford Nanopore) de muestras de esputo y de cepas puras. Las mejores condiciones serán usadas para evaluar el límite de detección en mezclas de aislados mediante el test de proporciones y el secuenciamiento usando MinION. Determinación de la sensibilidad del secuenciamiento MinION. La heterorresistencia será estimada mediante el análisis de 100 muestras de esputo y cepas puros de pacientes con tuberculosis recientemente diagnosticados. Las muestras serán recolectadas de pacientes en Iquitos y Lima, tras lo cual serán transportadas al laboratorio de Mycobacterium en la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). Las muestras descontaminadas serán usadas para determinar la susceptibilidad a isoniacida, rifampicina y pirazinamida mediante MODS,test de proporciones y el secuenciamiento con MinION. Los cultivos puros obtenidos de los pozos controles del MODS serán procesados de la misma manera que el descontaminado con el objetivo de conocer la susceptibilidad a isoniacida, rifampicina y pirazinamida. Luego las muestras que presenten más de 4 ml de volumen serán secuenciadas en el Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Regional de L