Bases genómicas y funcionales del mecanismo alternativo de resistencia a pirazinamida que involucra el rol de bombas de eflujo putativas de ácido pirazinoico en Mycobacterium tuberculosis con pncA silvestre.

La tuberculosis (TB), causada por Mycobacterium tuberculosis, mantiene una alta carga sanitaria y es agravada por la expansión de la farmacorresistencia. Para 2024 se estimó que 10.7 millones de personas enfermaron de TB y ocurrieron 1.23 millones de muertes; además, alrededor de 390,000 personas desarrollaron TB multidrogo-resistente o resistente a rifampicina. En este escenario, la resistencia a pirazinamida (PZA) es especialmente crítica porque compromete esquemas que dependen de su actividad esterilizante. A escala global se ha estimado una prevalencia agrupada de resistencia a PZA de 16.2% en el conjunto de casos, que aumenta hasta cerca de 60% en TB MDR; en Lima, Perú, se ha descrito 6.6% en una cohorte amplia y 47.7% en el subgrupo MDR, subrayando el peso local del problema. PZA es un profármaco que se convierte a ácido pirazinoico (POA) por la pirazinamidasa codificada por pncA, y su eficacia está modulada por el microambiente y por el manejo celular del metabolito activo. Aunque las mutaciones en pncA explican la fracción mayoritaria de la resistencia (estimaciones del 70 al 97%), persisten aislados pncA silvestres con fenotipo resistente y, con frecuencia, resultados discordantes entre ensayos. Esta discordancia es mecanísticamente informativa: el ensayo de Wayne refleja la liberación de POA, mientras que las pruebas de susceptibilidad capturan el efecto neto sobre el crecimiento bajo condiciones controladas. De hecho, la velocidad de extrusión de POA se ha propuesto como un predictor de resistencia a PZA frente a BACTEC 460, sugiriendo que el transporte del metabolito puede ser un determinante alternativo y cuantificable cuando pncA no está alterado. La presente propuesta aborda este vacío mediante una integración de genómica, bioinformática estructural y validación funcional, con foco en bombas de eflujo putativas implicadas en el transporte de POA, especialmente Rv1258c y Rv0191. El proyecto se organiza en dos hitos en 18 meses. En el Hito 1 analizaremos 16 aislados clínicos con pncA idéntico a H37Rv, seleccionados por perfiles fenotípicos altamente informativos que capturan concordancias y discordancias Wayne/Bactec. Se obtendrán genomas completos por secuenciación de lecturas largas y se implementará un análisis comparativo contra la referencia H37Rv para construir un catálogo curado de variantes. La priorización se centrará en genes de eflujo asociados a POA, controlando por linaje y recurriendo a modelamiento estructural comparativo para ubicar sustituciones en regiones interpretables de transportadores de membrana; variantes de referencia reportadas en Rv1258c se usarán como anclas para calibrar la interpretación in silico. En el Hito 2 se generará una cepa isogénica H37Rv con doble deleción Rv1258c–Rv0191, confirmada por verificación genotípica, para poner a prueba directamente la hipótesis de redundancia y compensación del eflujo de POA. La caracterización funcional en condiciones ácidas integrará una lectura cuantitativa de la cinética de POA (ensayo tipo Wayne con métricas derivadas) y la determinación de MIC de PZA en un rango amplio, incorporando medidas de fitness y crecimiento para distinguir efectos primarios de transporte de efectos pleiotrópicos. La comparación sistemática entre doble deleción, deleciones simples y H37Rv permitirá estimar si la perturbación combinada reduce de forma más marcada el eflujo residual y cómo se traduce en cambios en la susceptibilidad. Como producto, el proyecto dejará un conjunto de datos genotipo–fenotipo curado en aislados pncA silvestres, un ranking documentado de variantes con soporte genómico y estructural, y una plataforma isogénica para evaluar compensación de eflujo en un fondo genético controlado. En conjunto, estos resultados consolidarán un marco explicativo para resistencia a PZA más allá de pncA, habilitando líneas futuras sobre epistasis y regulación del eflujo bajo estrés, y sustentando estrategias de vigilancia molecular y de modulación farmacológic